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Gewählte Publikation:
Kluge, T.
Etablierung eines Verfahrens zur Diagnostik monogener Erkrankungen in der Reproduktionsmedizin
Humanmedizin; [ Diplomarbeit ] ; 2015. pp.
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Betreuer*innen:
- Geigl Jochen Bernd
- Altmetrics:
- Abstract:
- Die Analyse der Polkörper ist für Kinderwunschpaare, mit einer bekannten genetischen Vorbelastung der Mutter, eine vielversprechende Methode ein nicht-betroffenes Kind zu bekommen. Die Untersuchung des ersten und zweiten Polkörpers ermöglicht hierbei Rückschlüsse auf genomische Veränderungen der korrespondieren Eizelle. Hiermit ist es jedoch nur möglich mütterliche Allele zu untersuchen. In der Präimplantations- und Präfertilisationsdiagnostik ist die präzise Vervielfältigung des genetischen Materials die größte Herausforderung. Unentdeckte Kontaminationen oder Amplifikationsfehler, wie Allelic Dropout, können zu folgenschweren Fehldiagnosen führen. Ziel war es, ein präzises und sicheres Verfahren zur Vervielfältigung und Untersuchung des genetischen Materials von Polkörpern zu etablieren und einen Leitfaden für die Diagnostik monogener Erkrankungen in der Reproduktionsmedizin zu entwickeln. Hierfür wurden zunächst verschiedene Protokolle zur gesamt-genomischen oder sequenz-spezifischen Amplifikation der DNA von Einzelzellen miteinander verglichen und die labortechnischen Methoden soweit optimiert, dass eine fehlerfreie Vervielfältigung der DNA für eine weiterführende Untersuchung möglich wurde. Durch direkte Sequenzierung der krankheitsspezifischen Region und indirekte Analyse mittels eng benachbarter informativer Marker wurden die Proben auf das Vorhandensein einer spezifischen monogenen Erkrankung sowie Lyse- und Amplifikationsfehler untersucht. Eine sequenzspezifische Amplifikation mittels Nested-PCR erzielte hierbei die besten Ergebnisse und überzeugte durch eine sichere Vervielfältigung und eine sehr gute Darstellung der Marker sowie der Nukleotid-Abfolge in der Sequenzierung. Dieses erfolgsversprechende Protokoll wurde, in Zusammenarbeit mit einem Kinderwunschzentrum, bei den Polkörpern einer Patientin mit Ornithintranscarbamylase-Defekt angewandt. Um das mutationstragende Allel zu identifizieren, wurde zunächst ein familienspezifisches Testsystem entwickelt. Daraufhin wurden, nach hormoneller Stimulation der Patientin, 24 Eizellen gewonnen und mittels ICSI befruchtet. Die Analyse von 36 gewonnen Polkörper ergab, dass zehn Eizellen erfolgreich befruchtet waren. Davon fanden sich bei zwei Proben jeweils ein erster Polkörper mit einem mutations-tragendem Allel und ein zweiter Polkörper mit Wildtyp-Profil. Die korrespondierenden Eizellen waren also mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit frei von der Mutation im OTC-Gen. Dies wurde der Patientin und dem behandelnden Kinderwunschzentrum mitgeteilt und die Eizellen dort transferiert.