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Selected Publication:

Obrist, B.
Development of a high resolution imaging method of lipases with fluorescence and electron microscopy.
[ Diplomarbeit/Master Thesis ] Uni Graz; 2014. pp.80.

Authors Med Uni Graz:
Advisor:: Birner-Grünberger Ruth
Altmetrics:
Abstract:: Übergangszustand des Substrates und binden irreversibel. Solche activitybased probes (ABP) können mit diversen Reportermolekülen gekoppelt und dadurch detektiert werden. Um Sensitivität zu erhöhen und Hintergrundreaktionen zu senken, wird das Reportermolekül an den Enzym-gebundenen Linker gekoppelt. Die Durchführung geschieht mittels ‚Click-Chemie‘ (Azidealkyne Huisgen cycloaddition; CuAAC) (Schittmayer und Birner-Grünberger, 2009). CuAACReaktionen sind schnell und effizient, aber nur bedingt für in-vivo Anwendungen geeignet. Cu(I)- Ionen katalysieren die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und sind somit zytotoxisch. Oxidative Schäden von Biomolekülen und des zellulären Stoffwechsels wären die Folgen (Kennedy et al., 2011; Viertler, 2012). Deshalb werden bioorthogonale chemische Reaktionen angewendet, die nicht in intrazelluläre Prozesse eingreifen (Hang and Bertozzi, 2003). In dieser Arbeit wird ‚strainpromoted alkyne-azide cycloaddition‘ (SPAAC) verwendet, um Azide und Cyclooctinderivate in einer [3+2]-Cycloaddition zusammenzuführen (Agard et al., 2004). Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer ‚activity-based SPAAC‘-Methode um Lipasen mit hoher Auflösung an konfokalen Fluoreszenzmikroskopen oder Elektronenmikroskopen nachzuweisen. Lipasen in lebenden Zellen wurden mit spezifischen Phosphonat-Inhibitoren markiert und konnten durch eine modifizierte indirekte immunzytochemische Methode subzellulär nachgewiesen und hochauflösen lokalisiert werden. Die entwickelte Methode könnte in zukünftigen Experimenten zur Aufklärung von Ursachen und Folgen der enzymatischen Disfunktionen in Stoffwechselerkrankungen, wie Fettleibigkeit, Diabetes mellitus Typ 2 oder koronaren Herzerkrankungen Einzug finden.