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Selected Publication:
Glänzer, D.
Elektrophoretische Darstellung der Isoformen von beta2-Glykoprotein-I
[ Diplomarbeit/Master Thesis ] Technische Universität Graz; 2013. pp.75.
- Authors Med Uni Graz:
- Advisor:
- Gries Anna
- Altmetrics:
- Abstract:
- Das humane β2-Glykoprotein-I (Apolipoprotein H) ist ein Plasmaglykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 50 kDa und wird primär in der Leber exprimiert. Das Protein ist mit Lipoproteinen assoziiert und bindet an negativ geladene Phospholipidvesikel, Blutplättchen, DNA, Zellmembranen und Endothelzellen. β2-Glykoprotein-I weist genetisch determinierte strukturelle Polymorphismen auf, die mittels isolektrischer Fokusierung (IEF) und Immunoblotting detektierbar sind. Hierbei wurden die Allele APOH*1, APOH*2 und APOH*3 beobachtet und ein weiteres Allel, APOH*4, das nur in Populationen afrikanischer Abstammung vorkommt. β2-Glykoprotein-I besitzt endständige Sialinsäuren, die für die negative Außenladung eukaryotischer Zellen mitverantwortlich sind. Für die Abspaltung dieser endständigen Sialinsäure ist das Enzym Neuraminidase verantwortlich. Die sialinsäurefreien Glykoproteine werden durch den Asialo-Glykoproteinrezeptor in die Hepatozyten aufgenommen und über die Galle ausgeschieden. Zielstellung: Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu standardisieren, bei der die Isoformen von β2-Glykoprotein-I und Asialo β2-Glykoprotein-I direkt aus dem Plasma mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung aufgetrennt werden sollten. Methoden: Die SDS-PAGE wurde verwendet um die Reinheit der verwendeten Proben zu überprüfen, wobei die Darstellung mit Coomassie-Brilliant-Blau und Immunoblotting erfolgte. Zur Auftrennung der Isoformen von β2-Glykoprotein-I und Asialo-β2-Glykoprotein-I kam ein vertikales System der IEF zum Einsatz. Hierbei wurden die Proben in nativer und denaturierender Form im Fokussiergel aufgetrennt und durch Immunoblotting dargestellt. Zur Erhöhung der Löslichkeit der Proteine bei der IEF wurden Harnstoff und CHAPS verwendet. Ergebnisse und Diskussion: Die IEF der nativen Proben von β2-Glykoprotein-I zeigte 14 Isoformen mit isoelektrischen Punkten zwischen 4,7 und 8,5. Eine Auftrennung der Isoformen von Asialo-β2-Glykoprotein-I in nativer Form stellte sich aufgrund des Fehlens an Ladungen durch die Abspaltung der endständigen Sialinsäuren als sehr schwierig heraus, da es zu Löslichkeitsproblemen kam. Nach Zugabe denaturierender Reagenzien zur Löslichkeitserhöhung resultierten bei β2-Glykoprotein-I fünf Isoformen mit hoher Auflösung, wobei es scheint, dass der Harnstoff die natürliche Konformation von β2-Glykoprotein-I soweit verändert, dass auch die Anzahl der darstellbaren Isoformen abnimmt. Eine Auftrennung von Asialo β2-Glykoprotein-I in denaturierter Form zeigte zwei scharf begrenzte Isoformen im pH-Bereich zwischen 8,3 und 8,5. Da durch die Abspaltung der Sialinsäuren nur mehr zwei Isoformen darstellbar sind, ist anzunehmen, dass der Großteil der Isoformen von β2-Glykoprotein-I durch unterschiedlichen Sialinsäuregehalt zustande kommt.