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Gewählte Publikation:
Verheyen, S.
Gentechnische Herstellung und Charakterisierung des DNA Konstruktes pIRESGßg zur Untersuchung von GIRK Protein in Brustkrebszellen
[ Diplomarbeit ] Medical University of Graz; 2013. pp. 53
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Betreuer*innen:
- Schreibmayer Wolfgang
- Steinecker-Frohnwieser Bibiane
- Altmetrics:
- Abstract:
- Brustkrebs ist der am häufigsten diagnostizierte Krebs der weiblichen Bevölkerung. Viele hoch komplexe und teilweise unbekannte Vorgänge der Signalübertragung und des Zellstoffwechsels sind in die Tumorentstehung und den Metastasierungsprozess involviert. In einer vergleichenden Genom-Expressionsanalyse konnte die Überexpression der mRNA für den G-Protein-gekoppelten einwärts-gleichrichtenden Kaliumkanal 1 (GIRK1) in Brustkrebszellen festgestellt werden. Diese Überexpression ist signifikant mit Lymphknotenmetastasen assoziiert. Immunhistochemisch konnte in operativ gewonnenem Brustkrebsgewebe eine signifikante Überexpression des GIRK1 - Proteins nachgewiesen werden. In Brustkrebszelllinien konnte bei Überexpression der mRNA allerdings keine Überexpression des vollständigen Proteins nachgewiesen werden, vermehrt war nur ein GIRK1-Protein mit geringerem Molekulargewicht, welches nicht in der Lage ist funktionsfähige Kanäle zu formen. Als Ionenkanal moduliert GIRK1 die Erregbarkeit von Neuronen und die Herzfrequenz und steuert die Hormonausschüttung endokriner Organe. GIRK1 kann durch die G-Protein-Untereinheit Gßg aktiviert werden. Um die Funktionen von GIRK1 in Brustkrebs-Zelllinien weiter charakterisieren zu können, wurde ein Vektor hergestellt, mit welchem es möglich ist, die G-Protein-Untereinheit Gß1g2 in die Zellen einzubringen und GIRK1 zu aktivieren. Die zwei Teile der G-Protein-Untereinheiten Gß1 und Gg2 wurden in den Vektor pIRES kloniert. Gß1 ist zur Detektion in der Zelle mit einem Fluoreszenz-Protein (yellow fluorescent protein, YFP) fusioniert. Die erfolgreiche Klonierung der beiden Inserts konnte durch die Sequenzierung der Gene für Gß1 und Gg2 in pIRES bestätigt werden. Um auch die Funktionsfähigkeit des Konstruktes zu beweisen, wurde der Vektor mit den beiden Inserts Gß1 und Gg2, pIRESGß1Gg2, in MCF-7-Zellen transfektiert. Die Proteinexpression der G-Protein-Untereinheit konnte durch die Fluoreszenz von YFP mikroskopisch nachgewiesen und lokalisiert werden.