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Gewählte Publikation:
Niederl, F.
Herstellung von gentechnisch manipulierten Krebszelllinien, welche GIRK1 Splicevarianten stabil und genomintegriert exprimieren
[ Diplomarbeit ] Medical University of Graz; 2013. pp. 63
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Betreuer*innen:
- Schreibmayer Wolfgang
- Steinecker-Frohnwieser Bibiane
- Altmetrics:
- Abstract:
- Ziel dieser Diplomarbeit war es, Zelllinien anzufertigen, die einzelne alternative Splicevarianten von GIRK1 (GIRK1c, GIRK1d, GIRK1e) stabil und genomintegriert exprimieren. An diesen Zelllinien sollen dann vitale Parameter wie Proliferation, Wundheilung, Motilität und Invasion bzw. Ionenkanalausstattung untersucht werden (nicht Gegenstand dieser Diplomarbeit). Beim GIRK1 Protein handelt es sich um eine Untereinheit von G-Protein aktivierten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen (GIRKs). GIRKs sind verantwortlich dafür, dass die Zelle auf das Vorhandensein von extrazellulären Botenstoffen reagieren kann. Bisher etabliert war die Bedeutung von GIRKs bei der Regulation der Herztätigkeit durch das autonome Nervensystem (Vagusnerv) aber auch bei zentralnervösen Prozessen, wie bei der Schmerzbehandlung durch Opiate. Die Untersuchungen, die an der Medizinischen Universität Graz durchgeführt wurden zeigten, dass die Anzahl der Kopien von der mRNA des KCNJ3 Gens, welches für das GIRK1-Protein kodiert, im Brustkrebsgewebe extrem erhöht ist (Wagner, et al., 2010). Diese Erhöhung korreliert im Einzelnen positiv mit der Agressivität des Tumors, Vorkommen und Anzahl der Metastasen in den Lymphknoten und negativ mit der Lebenserwartung. Auf zellulärer Ebene führt alternatives ¿RNA editing¿ letztlich zur Translation von 4 verschiedenen GIRK1 Proteinen in den Krebszellen (GIRK1a, c, d und e). Es existieren Konstrukte, welche für fluoreszenzmarkierte Versionen von GIRK1c, d und e kodieren und zur Transfektion von Krebszellen geeignet sind. Diese Konstrukte wurden zunächst transient in die MCF7 Zelllinie eingebracht, durch entsprechenden Selektionsdruck wurde ein stabiler Einbau in das Genom der Krebszellen erreicht. Die erfolgreiche Integration wurde im Konfokalmikroskop kontrolliert. Anschliessend erfolgte eine Klonierung der positiven Zellen mittels FACS (fluorescense activated cell sorting).