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Gewählte Publikation:
Ulrich, D.
Bestimmung der Immunglobulinproduktion mittels ELISPOT-Technik. Detection of the immunoglobulin-production by using the ELISPOT - assay
[ Diplomarbeit ] Medical University of Graz; 2013. pp. 80
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Betreuer*innen:
- Brezinsek Hans-Peter
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- Abstract:
- Der B-Zell ¿enzyme-linked immuno spot¿ (ELISpot) ist noch kein Standardinstrument zur quantitativen Messung von antigenspezifischen B-Zellen. Schuld daran ist der Mangel an entsprechenden Reagenzien und die fehlende Standardisierung bezüglich der Zellanzahl, Art der Zellen und die Konzentration des Antigens. Ziel dieser Arbeit war es diese Variablen, auf Basis eines kommerziell erhältlichen ELISpot Kits, zum Nachweis Immunglobulin G (IgG)-produzierender peripherer B-Zellen bei 6 Probanden näher zu charakterisieren. Zur Bestimmung eines spezifischen IgG wurde das Antigen Tetanus Toxoid (TT) in einer Konzentration von 5µg/ml verwendet, zur Bestimmung der Anzahl von IgG-produzierenden B-Zellen wird anti-IgG (aIgG) auf die ELISpot Platten gebunden. Die Zellkonzentration wurde abhängig vom Liganden (TT oder aIgG) gewählt und lag bei 200.000 und 400.000 Zellen/Well (TT) beziehungsweise 50.000 und 100.000 Zellen/Well (aIgG). Es wurden sowohl eingefrorene PBMC als auch frisch isolierte periphere mononukleäre Zellen (PBMC) verwendet. Die Zählung der positiven Spots erfolgte durch einen ELISpot Reader. Beim spezifischen TT B-Zell ELISpot zeigt sich wie erwartet ein höheres positives Ergebnis, je kürzer die letzte Auffrischungimpfung zurückliegt. Um die Spotzahl zu ermitteln, die Positiv von Negativ trennt, wurde eine Grenzwertoptimierungskurve erstellt. Bei einer Spotzahl von über 3,5 lag die Sensitiviät bei 44% und die Spezifität bei 100%, weshalb Wells mit ¿ 4 Spots als positiv gewertet wurden. Weiters kann durch die Verwendung einer höheren Zellzahl (400.000 Zellen für den Nachweis von TT-spezifischen B-Zellen und 100.000 Zellen zur Bestimmung aller IgG-produzierender B-Zellen), eine bessere Trennung zwischen negativ und positiv erzielt werden. Zuletzt zeigte sich auch, dass die Voraktivierung der B-Zellen über Toll-like Rezeptor 7 (TLR-7) und Interleukin 2 (IL-2) die Spotzahl deutlich erhöht. Aufbauend auf diesen Daten konnte nun eine Anleitung zur routinemäßigen Durchführung eines B-Zell-ELISpot erstellt werden.