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Gewählte Publikation:
Kletzmayr, M.
Herstellung von rekombinanten Proteinfragmenten von hGIRK1a für die Herstellung von sequenzspezifischen Antikörpern
[ Diplomarbeit ] Graz Medical University; 2012. pp. 84
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Betreuer*innen:
- Schreibmayer Wolfgang
- Steinecker-Frohnwieser Bibiane
- Altmetrics:
- Abstract:
- In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass im Gewebe eines invasiv wachsenden Brustkrebses in 30% der Fälle eine Überexprimierung von mRNA, welche für das GIRK1 codiert, gefunden werden kann. Dies wurde verglichen mit dem Gewebe der gesunden Brust von derselben Person(10). GIRK oder auch Kir3.x (G protein gated Kir channels) sind Kanäle, die durch Gß¿ Untereinheiten von PTX-sensitiven G Proteinen aktiviert werden(1). Vom GIRK1-Gen konnten zurzeit 4 Splice Varianten isoliert werden(12). Der bereits vorhandene Antikörper erkennt dabei noch nicht alle. In dieser Arbeit wurde versucht, vom N-terminale Ende des hGIRK1a vier geeignete Sequenzabschnitte (MK1-MK4) für die Herstellung von rekombinanten Proteinfragmenten zu finden. Diese sollten zur Herstellung von sequenzspezifischen Antikörpern verwendet werden, die sämtliche Splicevarianten erkennen können. Zur Herstellung von den Proteinfragmenten wurde zuerst eine Prüfung der chemischen und physikalischen Eigenschaften des Sequenzabschnittes in silico mittels der GCG Software durchgeführt. Anschließend wurden diese Abschnitte (MK1-4) mit geeigneten Primern mit einem PCR-Verfahren vervielfältigt und durch eine Ligation in den Vektor pHex-4T-1 eingebaut. Um die Vektoren mit den Inserts in die Bakterienzellen zu transferieren, wurde eine Elektroporation durchgeführt. Mittels einer Restriktionsanalyse wurde überprüft, ob die richtigen Inserts in den Vektoren vorhanden sind. Um genetische Mutationen im DNA-Strang auszuschließen, wurden diese zur Sequenzierung verschickt. Danach konnte mit der Proteinsynthese die erforderliche Proteinmenge (2mg) von MK1, MK2 und MK4 hergestellt werden. Die Bradfordbestimmung ergab eine Proteinmenge für MK1 von 4,22mg, für MK2 von 2,01mg und für MK4 von 4,72mg. Der Reinheitsgrad und das Molekulargewicht der gewonnenen Proteine wurden anschließend mit der SDS-PAGE bestimmt. Anhand der Standardkurve wurde für MK1 ein Molekulargewicht von 12705Da, für MK2 eines von 24490Da und für MK4 eines von 13031Da gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass vom N-terminalen Ende rekombinante Proteinfragmente hergestellt werden können. Diese werden nun genutzt, um sequenzspezifische Antikörper für den hGIRK1a herzustellen. Da noch keine für die gesamten Splice Varienten vorhanden sind, würde dies eine weitere Ansatzmöglichkeit für die Erforschung und Behandlung von Brustkrebs bedeuten.