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Gewählte Publikation:
Brunner, A.
Sphingolipide als autokrine Wachstumsfaktoren für Glioblastomzellen
[ Diplomarbeit ] Medical University of Graz; 2012. pp. 101
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Brunner Anna
- Betreuer*innen:
- Sattler Wolfgang
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- Abstract:
- Hintergrund:Das Glioblastoma Multiforme gilt als der häufigste primäre Tumor des Zentralen Nervensystems. Sphingosin-1-Phosphat, ein bioaktives Lipid reguliert nicht nur die zelluläre Proliferation, sondern auch die Migration und das zelluläre Überleben. Aus einer Verschiebung des Sphingolipid-Rheostats zu Gunsten von S1P resultiert ein Überlebensvorteil maligner Zellen. Fragestellung: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Sphingosin-1-Phosphat Synthese, des Exports und der Signaltransduktionswege auf die Proliferation von Glioblastomzellen zu untersuchen. Methoden: S1P Zugabe: Je nach Versuchsanordnung wurden 40.000, 60.000 oder 100.000 Zellen am Tag null auf 12-Wells ausplattiert, für 6 oder 48 Stunden serumfrei kultiviert und dann mit BSA-gebundenem S1P stimuliert. 3 bzw. 5 Tage nach der ersten S1P-Zugabe wurden die Zellen trypsinisiert und am Cell Counter gezählt. Hemmung der endogenen Sphingolipidsynthese durch Verwendung pharmakologischer Antagonisten: 100.000 Zellen wurden am Tag null auf 12-Wells ausplattiert, für 24 Stunden serumfrei kultiviert und dann mit den Inhibitoren SKI-II, Myriocin, Desipramine, Fumonisin B1 oder GW4968 versetzt. Nach Inkbuation der Zellen für 3 Tage in An- bzw. Abwesenheit von exogen zugesetztem S1P wurden sie trypsinisiert und am Cell Counter gezählt. Analyse der ABCA1-Expression mittels Western Blot: Nach Aussaat der Zellen auf 6-Wells und 6-stündiger serumfreier Inkubation erfolgte die Zugabe von S1P, sowie von natürlichen und synthetischen LXR-Agonisten. Nach 24 Stunden wurden die Zellen trypsinisiert. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford Protein Assay bestimmt. Nach Bestimmung der Protein-Aliqouts wurden die Zelllysate mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und immunreaktiver ABCA1 mittels eines Rabbit-Anti-ABCA1-Antikörpers detektiert. Als Sekundärantikörper wurde HRP-markierter Antikörper (goat-anti-rabbit) verwendet. Die Banden wurden mittels ECL+-Reaktion visualisiert. Inhibierung von ABCA1 durch pharmakologische Antagonisten: 100.000 Zellen wurden am Tag null auf 12-Wells ausplattiert, für 6 Stunden serumfrei kultiviert und dann mit den ABCA1-Antagonisten Glyburide und DIDS versetzt. Nachdem die Zellen für 3 Tage in der An- und Abwesenheit von exogen zugesetztem S1P kultiviert worden sind, wurden sie trypsinisiert und die Zellzahlen bestimmt. Resultate: S1P stimuliert die Proliferation von U87MG Zellen: Die exogene Zugabe von S1P bewirkt eine signifikante Proliferationssteigerung. BSA-gebundenes S1P führte zu einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der Zellzahl um das 1,3- bzw. das 1,5-fache (100 nM, 10 µM) verglichen mit den Kontrollen (bei Inkubation für 5 Tage). Pharmakologische Hemmung des Sphingolipidmetabolismus führt zu einer Zellzahlreduktion von U87MG Zellen: Bei Verwendung pharmakologischer Antagonisten des endogenen Sphingolipidmetabolismus resultierten bei U87MG Zellen folgende antiproliferative Effekte: Reduktion der Zellzahl im Vergleich zu den Kontrollen: SKI-II (1 µM 40%, 5 µM 75%), Myriocin (0,1 µM 45%, 1 µM 50%, 5µM 33%, 10µM 55%), Desipramine (5 µM 30%, 10 µM 60%), Fumonisin B1 (10 µM 22%), GW4968 (1 µM 10% [Erhöhung], 10 µM 60%). ABCA1-Expression: Es konnte gezeigt werden, dass ABCA1 von U87MG Zellen unter basalen Bedingungen exprimiert wird. Bei Zugabe von S1P und von natürlichen (24- und 25-OH-Cholesterin) und synthetischen (T0901317) LXR-Agonisten zeigte sich eine Expressionssteigerung: S1P: um das 2-fache, 24-OH-Cholesterin: um das 9-fache, 25-OH-Cholesterin: um das 8-fache, T0901317: um das 22-fache. Pharmakologische Inhibitoren von ABCA1 bewirken eine Hemmung der Zellproliferation: Die Resultate dieses Versuchs zeigen eine deutlichen antiproliferativen Effekt der ABCA1-Antagonisten bei U87 Zellen mit einer signifikante Abnahme der Zellzahl um 40%. Exogen hinzugefügtes S1P (1 µM) bewirkte eine nahezu vollständige Aufhebung der Wachstumsblockade.