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Gewählte Publikation:
Berghold, V.
RNA-Interferenz in Hep G2 Zellen um die Aufgaben von BCS1L in der Atmungskette zu untersuchen
[ Diplomarbeit ] Medical University of Graz; 2010. pp. 88
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Betreuer*innen:
- Plecko Barbara
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- Abstract:
- Hintergrund und Fragestellung: Das humane BCS1L Gen codiert ein mitochondirales Protein, dessen Aufgabe als Chaperon der Einbau der Untereinheit Rieske Eisen-Schwefel Protein (RISP) in den Komplex III der Atmungskette ist. Mutationen des BCS1L führen zu unterschiedlich schwerwiegenden Mitochondriopathien wie das GRACILE Syndrom, Komplex III Defizienz und das Björnstad Syndrom. Das GRACILE Syndrom (Fellmans Syndrom, MIM #603358) ist charakterisiert durch Wachstumsretardierung, Aminoazidurie aufgrund von Tubulopathie, Cholestase, Eisenüberladung, Laktatazidose und frühem Tod. Komplex III Defizienz (MIM #124000) verursacht Enzephalopathie mit oder ohne viszeraler Beteiligung. Das Björnstad Syndrom (MIM #262000), welches mit angeborenen Gehörverlust und Pili torti manifestiert, ist mit dem Leben vereinbar. Zur Untersuchung der Funktion von BCS1L wurde das BCS1L Gen mittels RNA Interferenz in HepG2 Zellen, eine aus einem Leberzellkarzinom gewonnene Zelllinie, unterdrückt. Methoden: Um die Expression von BCS1L zu vermindern wurden die HepG2 Zellen mit ¿small interfering RNAs¿ (siRNAs) transfektiert, welche gegen die BCS1L mRNA gerichtet waren. Dies führt zum Abbau von mRNA und in weiterer Folge verhindert es die Expression des BCS1L Proteins. Um die maximale Reduktion des Einbaus von RISP zu erzielen, wurden die Transfektionen 3-mal in 2 Tages Abständen wiederholt. RNA wurde von BCS1L defizienten HepG2 Zellen und Kontrollen präpariert. Anschließend wurden cDNA synthetisiert und real-time PCR durchgeführt, um die Expressionsrate von BCS1L mRNA zu eruieren. Die verminderte Proteinexpression wurde mit SDS PAGE und Western Blot visualisiert. Der Einbau der RISP Untereinheit in den Komplex III wurde mit Blue Native PAGE untersucht. Die Zellen wurden im ¿high resolution respirometer¿ (Oroboros O2k Oxygraph) analysiert um die mitochondriale Atmungskettenaktivität zu bestimmen. Die Anzahl der Mitochondrien innerhalb der HepG2 Zellen wurde mittels Immunfluoreszenz untersucht. Die verwendeten Antikörper waren gegen Pyruvatdehydrogenase und Core1, eine weitere Untereinheit von Komplex III, gerichtet. Ergebnisse: Die Expression von BCS1L in HepG2 Zellen war im Vergleich zu den Kontrollzellen um 80-90% vermindert. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen zeigte Blue Native PAGE eine auffällige Verminderung von eingebautem RISP in Komplex III nach 6 Versuchstagen. Im Gegensatz dazu war es nicht möglich signifikante Veränderungen in der Atmungskettenfunktion im Vergleich zu unbehandelten Zellen festzustellen. Die Anzahl der Mitochondrien war in beiden Gruppen gleich groß. Schlussfolgerung: Das Untersuchungsdesign ermöglichte eine ausreichende Verminderung des Zielproteins um ein funktionelles Defizit zu verursachen, d.h. die abnormale Aggregation von Komplex III. Überraschenderweise funktionierte jedoch die mitochondoriale Atmung in vitro trotz der Komplex III Abnormalität. Aus diesem Grund postulieren wir, dass 20% der normalen BCS1L Expression ausreicht um eine suffiziente Atmungskettenfunktion aufrecht zu erhalten.