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Gewählte Publikation:
Zahiragic, S.
Quantifizierung und Modulation der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Kardiomyozyten der Maus
[ Diplomarbeit/Master Thesis ] Medical University of Graz; 2010. pp. 78
[OPEN ACCESS]
FullText
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Jasarevic Samra
- Betreuer*innen:
- Heinzel Frank
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- Abstract:
- Mitochondrien sind die wichtigsten Energielieferanten der Zelle. Calcium, als ubiquitärer Botenstoff, spielt eine wichtige Rolle in der Anpassung der ATP-Produktion in den Mitochondrien an den ATP-Bedarf der Zellen, da es drei Schlüssel-Dehydrogenasen des Zitratzyklus aktiviert. Außerdem spielen die Mitochondrien eine wichtige Rolle in der Apoptosen-Induktion während Ischämie/Reperfusion. Zelluläre Ca2+-Überladung führt zur Öffnung von PTP-Kanälen in der Mitochondrien-Innenmembran, was wiederum zur Freisetzung von proapoptotischen Molekülen führt. Ca2+ wird entlang des elektrochemischen Gradienten über den MCU in die Mitochondrien aufgenommen. Der Ca2+-Ausstrom aus den Mitochondrien wird vom NCXm getragen. Die Rolle der Mitochondrien in der Ca2+-Pufferung ist noch nicht vollständig geklärt. Es ist umstritten, ob die Mitochondrien Ca2+ schnell, auf einer sog. Schlag-zu-Schlag Basis, oder langsam über die Zeit, aufnehmen. Ziele unserer Studie waren es, eine quantitative Methode für Messungen der [Ca2+] in Maus-Kardiomyozyten zu etablieren und den Effekt von JTV-519 auf die mitochondriale Ca2+-Homöostase (MCU und NCXm) zu evaluieren Ventrikuläre Kardiomyozyten von FVB/N Mäusen wurden mit Hilfe der Kollagenase am Langendorff-Perfusionssystem isoliert. Um das mitochondriale Ca2+ zu bestimmen, wurden die Zellen mit dem Zell-permeablen Ca2+-Indikator Rhod-2 AM inkubiert. Für unsere Versuche wurden die Zellen mit Digitonin oder Saponin permeabilisiert und anschließend mit Plasma-ähnlicher internal solution perfundiert. Danach wurden die Kardiomyozyten den Low- und High-Ca2+-Lösungen ausgesetzt, die jeweils 95 nM und 522 nM freies Ca2+ enthielten. Das gleiche Protokoll wurde mit und ohne MCU- und NCXm-Blocker, Ru360 und CGP-37157 ausgeführt. Um die Analyse der Fluoreszenzanstiege in den Mitochondrien durchzuführen, wurden ROIs (regions of interest) an den Mitochondrien und am Zytosol der konfokalen Bilder definiert. Alle Fluoreszenz-Werte wurden auf den Fluoreszenz-Wert bei 95 nM Ca2+ normalisiert. Rhod-2 in einer Konzentration von 20 M eignet sich als mitochondrialer Ca2+-Indikator in Maus-Kardiomyozyten. Saponin in einer Konzentration von 0,01 % eignet sich für die Membran-Permeabilisierung in Maus-Kardiomyozyten. Der Fluoreszenz-Anstieg wurde in Anwesenheit von Ru360 und CGP vermindert. Prevention der mitochondrialen Ca2+-Überladung und der Öffnung der PTP-Kanäle ist ein wichtiger Ansatz in der Behandlung der Herzinsuffizienz. Unsere Ergebnisse zeigten, dass unter Applikation von Ru360 und CGP die mitochondriale Ca2+-Aufnahme in Kardiomyozyten signifikant vermindert werden kann.