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Grabner, A.
Aufschlüsselung des Proteoms von organischen Kationentransportern: Identifizierung und funktionelle Implikationen des lysosomal associated protein transmembrane 4 alpha (LAPTM4A) als neuen Interaktionspartner des humanen organischen Kationentransporters 2 (hOCT2)
[ Dissertation ] Medical University of Graz; 2009. pp. 121
[OPEN ACCESS]
FullText
- Authors Med Uni Graz:
- Advisor:
- Holzer Herwig
- Altmetrics:
- Abstract:
- Der humane organische Kationentransporter 2 (hOCT2) ist ein transmembranäres Protein mit hoher renaler Expression, welches in den polyspezifischen Transport von endogenen und exogenen organischen Kationen (Monoaminsubstrate beziehungsweise Medikamente) involviert ist. In der Niere ist der hOCT2 an der basolateralen Membran von Zellen des proximalen Tubulus lokalisiert, wo er für den ersten Schritt der Ausscheidung von organischen Kationen verantwortlich ist. Es ist bereits bekannt, dass hOCT2 über mehrere verschiedene Signalwege reguliert werden kann. Daher ist die Identifizierung von Proteinen, die direkt mit dem hOCT2 interagieren von großer Bedeutung, um die Mechanismen der Funktion und Regulation des hOCT2 aufzuklären. Für die Identifizierung von neuen Interaktionspartnern wurde ein mating based Split Ubiquitin Yeast-Two-Hybrid (Y-T-H) System etabliert, welches im Gegensatz zu klassischen Y-T-H Techniken die Detektion von Interaktionen direkt in der Plasmamembran erlaubt. Mi Hilfe dieses Systems wurde das lysosomal associated protein transmembrane 4 alpha (LAPTM4A) als Interaktionspartner von hOCT2 identifiziert. Bei LAPTM4A handelt es sich um ein transmembranäres Protein welches mit Lysosomen und späten Endosomen assoziiert ist. Das Protein besitzt selbst Transportfähigkeit und ist am Transport einer Reihe von Substanzen, die auch als Substrate von organischen Kationentransportern bekannt sind, beteiligt und ist für die Kompartimentierung von amphiphilen Lösungen in der Zelle zuständig. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass LAPTM4A die Zellsensibilität gegenüber Medikamenten verändert (Ethidiumbromid, Östradiol). Die Interaktion von hOCT2 und LAPTM4A konnte in dieser Arbeit mit Hilfe eines Pulldown Assays bestätigt werden. Dafür wurde His-getaggtes LAPTM4A an Talon Sepharose Beads gekoppelt und mit einem Lysat von hOCT2 stabil exprimierenden HEK 293 Zellen inkubiert. Im anschließenden Westernblot konnte hOCT2 in den Eluaten nachgewiesen werden. Die Interaktion von hOCT2 und LAPTM4A hat auch eine funktionelle Relevanz. Die Transfektion von HEK 293 hOCT2 Zellen mit LAPTM4A führte zu einer signifikant verminderten Aufnahme des fluoreszierenden organischen Kations 4-4-Dimethylamino-Styryl-N-Methylpyridinium (ASP+) im Vergleich zu untransfizierten Zellen (-233% n=31), während die Transfektion eines Leervektors keinen statistisch signifikanten Effekt auf die ASP+-Aufnahme hat (+44% n=24 verglichen mit Kontrollzellen). Diese Ergebnisse sprechen für einen negativen Effekt von LAPTM4A auf den hOCT2.