Medizinische Universität Graz Austria/Österreich - Forschungsportal - Medical University of Graz
Gewählte Publikation:
Lohberger, B.
Molekulare Determinanten der beta-adrenergen Regulation des humanen Herz-Na+-Kanals Nav1.5
[ Dissertation ] Medical University of Graz; 2004. pp.
- Autor*innen der Med Uni Graz:
- Lohberger Birgit
- Betreuer*innen:
- Quasthoff Stefan
- Schreibmayer Wolfgang
- Altmetrics:
- Abstract:
- Catecholamine vermitteln die Regulation des Herzschlages durch den Nervus sympathicus über verschiedene Isoformen des beta-adrenergen Rezeptors. Pharmakologisches Eingreifen in die beta-adrenerge Rezeptorfunktion ist ein wichtiges Mittel zur Behandlung von Herzerkrankungen. Der intrazellulläre Linker zwischen Domäne I und II (ID I-II) konnte als diejenige Region identifiziert werden, die für die PKA-Phosphoylierung am humanen Herz-Na+-Kanal verantwortlich ist (Frohnwieser et al., 1997). Als erstes wurde die physiologische Rolle des ID I-II Linkers untersucht. Die cRNA des Linkers wurde synthetisiert und mit der cRNA der gesamten alfaNav1.5 in Xenopus laevis Oozyten koexpremiert. Die Injektion von cAMP im Zuge der zwei Elektroden Voltage-Clamp Messungen zeigten eine 30-40%ige Zunahme des INa+,Peak bei jenen Oozyten, die alfa Nav1.5 exprimierten. Eine Koexpression der cRNA des cytoplasmatischen ID I-II Linkers alfa Nav1.5 bewirkte eine hoch signifikante Reduktiondes, unter Kontrollbedingungen zu beobachteten Effekts. Interessanterweise ergaben Beobachtungen bezüglich der Veränderung des Spitzenstroms eine, durch Koexpression der alfa-Untereinheit mit dem isolierten ID I-II Linker, hervorgerufene konzentrationsabhängige Reduktion des Spitzenstroms. Die oben angeführten Ergebnisse, sowie Resultate verschiedener Studien weisen auf eine Regulation des Nav1.5 über PKA durch eine direkte Phosphorylierung des cytoplasmatischen ID I-II Linkers hin. Um dies genauer zu untersuchen, wurde im Zuge dieser Arbeit zahlreiche Mutationen durchgeführt und ein in-vitro Phosphorylierungs Assay entwickelt und angewendet. Der ID I-II Linker wurde in drei Teilstücke unterteilt und mittels in-vitro Mutagenese wurden alle 16 möglichen PKA Consensus-Sequenzen einzeln und in verschiedenen Kombinationen systematisch untersucht. Von den einzelnen Mutanten wurden GST-Fusionsproteine hergestellt und mittel Gluthathion-S-Transferase-beads aufgereinigt. Die Proteine wurden in Anwesenheit von P32-markierten ATP und der katalytischen Untereinheiten der PKA in-vitro phosphoryliert. Im ID I-II Teilstück A (aa 417-504) konnten die beiden Serine S476 und S483 als verantwortliche PKA-Bindungsstellen identifiziert werden. Im ID-II Telstück B (aa 505-615) inhibierte nur die Substititution aller 10, innerhalb von PKA Consensus-Sequenzen einzeln und in verschiednen Kombinationen systematisch untersucht. Von den einzelnen Mutanten wurden GST-Fusionproteien hergestellt und mittel GGluthathion-S-Transferase beads aufgereinigt.